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    Eswerden die Verbindung Daminin und Daminin-Derivate der allgemeinenFormel 23: beschrieben sowie Verfahrenzu ihrer Herstellung. Daminin zeigt in Zellkulturmodellen neuroprotektiveEigenschaften. Schließlichwird die Isolierung von Daminin aus dem Schwamm Axinella damicornisund die Synthese von Daminin und seinen Derivaten beschrieben.
    公开号:DE102004002885A1
    申请号:DE102004002885
    申请日:2004-01-20
    公开日:2005-08-18
    发明作者:Anna Prof. Aiello；Gerhard Prof. Dr. Bringmann；Michele D'esposito；Ernesto Prof. Fattorusso；Gerhard Dr. Lang；Marialuisa Prof. Menna；Werner E.G. Prof. Dr. Müller；Sanja Dr. Petrovic-Ottstadt；Heinz Christoph Dr. Schröder；Hideyuki Dr. Tsuruta
    申请人:Johannes Gutenberg-Universitaet Mainz；Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg；
    IPC主号:A61K31-4439
    专利说明:
    [0001] Dievorliegende Erfindung betrifft neue bioaktive Verbindungen aus derKlasse der Pyrrolalkaloide und Verfahren zur Herstellung dieserVerbindungen durch Isolierung aus natürlichen Quellen und durch chemische Synthese.Diese Erfindung betrifft weiterhin diese Verbindungen enthaltendeArzneimittel und deren Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten.
    [0002] Meeresschwämme sindeine reichhaltige Quelle an Pyrrolalkaloiden, einer Gruppe von Naturstoffen, diesich durch ihre strukturelle Vielfalt und interessante biologischeAktivitätenauszeichnet. Strukturelle Gemeinsamkeit der meisten Mitglieder dieserVerbindungsklasse ist die Pyrrol-2-Carbonsäuregruppe, welche durch einkurzes aliphatisches Verbindungsstück mit einem Heterozyklus,oft einer Aminoimidazoleinheit, verbunden ist.
    [0003] Alserste Verbindung dieser Klasse wurde das dibromierte Oroidin (1)isoliert, zuerst aus dem Schwamm Agelas oroides und später auchaus verschiedenen anderen Schwämmen(S. Forenza, L. Minale, R. Riccio, E. Fattorusso, J. Chem. Soc.,Chem. Comm. 1971, 13, 1129-1130). Im Laufe der letzten dreißig Jahrewurden zahlreiche weitere Pyrrolalkaloide mit vielfältigen biologischenAktivitätenisoliert, zumeist (aber nicht ausschließlich) aus Schwämmen derFamilien Agelisidae, Hymeniacidonidae und Axinellidae. So wurde zumBeispiel Keramadin (2), ein neuartiger Antagonist serotonerger Rezeptoren,aus einer von Okinawa stammenden Agelas-Spezies isoliert (H. Nakamura,Y. Ohizumi, J. Kobayashi, M. Kasei, Tetrahedron Lett. 1984, 25,2475-2478). Hymenidin (3), aus einem Hymeniacidon sp. (J. Kobayashi,Y. Ohizumi, H. Nakamura, Y. Hirata, Experientia 1986, 42, 1176-1177),und Clathrodin (4), aus dem karibischem Schwamm Agelas clathrodes (J.J. Morales, A. D. Rodriguez, J.
    [0004] Nat.Prod. 1991, 54, 629-631), sind die mono- bzw. unbromierten Analogavon Oroidin (1). Clathrodin wirkt, wie auch Oroidin, auf muscarinischeAcetylcholinrezeptoren (mAChR) in Membranen aus Rattengehirn, während Hymenidineine ausgeprägteantiserotonerge Wirkung besitzt. Eine antimikrobielle Wirkung vonOroidin ist ebenfalls bekannt. Die Tauroacidine A (5) und B (6),aus einer Hymeniacidon sp., sind Brompyrrolalkaloide mit einem Taurinrestam Aminoimidazolring (J. Kobayashi, K. Inaba, M. Tsuda, Tetrahedron1997, 53, 16679-16682); sie wirken als Inhibitoren der EGF-Rezeptor-Kinaseund der c-erbB-2-Kinase mit einem IC50 vonjeweils 20 μg/ml.Die verwandte Verbindung Taurodispacamid A (7) wurde aus dem mediterranen SchwammAgelas oroides isoliert und zeigte eine gute antihistaminische Aktivität am isoliertenMeerschweinchenileum (E. Fattorusso, O. Taglialatela-Scafati, TetrahedronLett. 2000, 41, 9917-9922). Eine ungewöhnliche N-Methylimidazoliniumgruppeenthalten Clathramide A (8) und B (9) (F. Cafieri, E. Fattorusso,A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati, Tetrahedron 1996, 52, 13713-13720),aus dem karibischen Schwamm Agelas clathrodes, die eine antifungischeWirkung gegen Aspergillus niger zeigen. Trotz ihrer Ähnlichkeitzu anderen, bioaktiven, Strukturen konnte bei diesen Verbindungenjedoch keine antihistaminische, antiserotonerge oder anticholinergeWirksamkeit beobachtet werden. Bei den Dispacamiden A bis D (10-13)handelt es sich um Brompyrrolalkaloide mit einer Aminoimidazoloneinheit(F. Cafieri, E. Fattorusso, A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati,Tetrahedron Lett. 1996, 37, 3587-3590; F. Cafieri, R. Carnuccio,E. Fattorusso, O. Taglialatela-Scafati, T. Vallefuoco, Bioorg. Med.Chem. Lett. 1997, 7, 2283-2288), sie wurden aus verschiedenen karibischenAgelas-Arten isoliert undweisen eine erstaunlich selektive antihistaminische Wirkung auf.Aus dem Schwamm Agelas nakamurai wurden Mukanadin B (14) (H. Uemoto,M. Tsuda, J. Kobayashi, J. Nat. Prod. 1999, 62, 1581-1583), miteiner Hydantion- an Stelle der Aminoimidazolongruppe, und die SlagenineA bis C (15-17) (M. Tsuda, N. Remoto, J. Kobayashi, TetrahedronLett. 1999, 40, 5709-5712), mit einem einzigartigem Tetrahydrofuro[2,3-d]imidazolidin-2-onring,isoliert. Die Manzacidine A bis D (18-21) (J. Kobayashi, F. Kanda,M. Ishibashi, H. Shigemori, J. Org. Chem. 1991, 56, 4574-4576; T.Jahn, G. M. König,A. D. Wright, Tetrahedron Lett. 1997, 38, 3883-3884), aus einerHymeniacidon sp., und Agelongin (22), aus Agelas longissima (F.Cafieri, E. Fattorusso, A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati, R.Carnuccio, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 799-804), stellen insoferneine strukturelle Neuerung unter den Pyrrolalkaloiden dar, als dasssie an Stelle des üblichenImidazolrings einen 3,4,5,6-Tetrahydropyrimidin- beziehungsweiseeinen Pyridinring und an Stelle der zentralen Amidbindung eine Esterbindungbesitzen. Agelongin besitzt eine antiserotonerge Wirkung an Funduspreparationenvon Rattenmagen.
    [0005] DasAnwendungsspektrum füreine kommerzielle Nutzung der neuen bioaktiven Substanzen, die interessantebiologische Aktivitätenbesitzen, ist sehr breit. Intensiv wird dabei auch nach solchenSubstanzen gesucht, die eine Behandlung von bisher kaum therapierbarenneurodegenerativen Erkrankungen, wie z. B. von Morbus Alzheimer,Morbus Parkinson oder Multipler Sklerose, ermöglichen.
    [0006] Intrazelluläres freiesCalcium [Ca2+]i istein sehr wichtiger Second-Messenger in der Stimulation vieler Zellen.Die Mobilisierung von Calcium spielt auch eine sehr große Rollebei verschiedenen Krankheiten, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungendes ZNS, Ischämie,Alzheimer-Krankheit, psychopathologischen Krankheiten und bei Alterungsprozessen.Dabei ist sowohl bei diesen Erkrankungen als auch bei direkten Verletzungendes Gehirns eine Erhöhungder intrazellulärenCa2+-Konzentration festzustellen. DiesererhöhteEinstrom von Ca2+ führt über eine Reihe von weiterenMechanismen zur fortschreitenden Zellzerstörung.
    [0007] Esist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue bioaktiveSubstanz aus einem marinen Organismus und strukturell verwandteVerbindungen, Verfahren zu deren Herstellung und zu deren Verwendungzur Verfügungzu stellen.
    [0008] Dievorliegende Erfindung betrifft das neue, aus dem Schwamm Axinelladamicornis isolierte, Alkaloid Daminin (24) sowie Alkaloide derallgemeinen Struktur 23.
    [0009] Agelongin(22) ist der bisher einzige Vertreter der allgemeinen Struktur 23,dabei ist R2 = Br und R1 sowieR3 bis R11 sindH.
    [0010] NeueSubstanzen wie das hier beschriebene Alkaloid Daminin (24), diedie intrazellu läreCa2+-Konzentration ([Ca2+]i) senken (z. B. nach der Inkubation mitNeurotoxinen oder Neurotransmittern) und ausgeprägte neuroprotektive Eigenschaftenbesitzen, könntenin Zukunft bei der Behandlung von derartigen Erkrankungen eine große Rollespielen.
    [0011] ImRahmen der vorliegenden Erfindung sollen die neuen Pyrrolalkaloideauch von der allgemeinen Formel 23 abgeleitete Verbindung sein,worin R1 bis R11 sowieX unabhängigvoneinander entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertesoder polysubstituiertes C1-C18-Alkyl,wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, Alkenyl,ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierterAryl- oder Heteroarylrest,eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe,eine Acylgruppe, wie z. B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl,Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine verzweigte oder Heteroatom-oder arylsubstituierte Acylgruppe, -OH oder -SH, (im Falle von R1, R3, R8,R10, und R11 mitAuftreten zusätzlicherTautomeren verbunden) ein Alkoxysubstituent, wie z. B. -OMe, -OEt,-OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, dessen Alkylgruppe verzweigt,unverzweigt oder cyclisch ist, eine über ein Schwefelatom gebundeneAlkylgruppe, wie -SMe, -SEt, oder eine Sulfonylgruppe, wie z. B.-SO3H, -SO2Me, -SO2CF3, -SO2C6H4CH3 oder SO2C6H4CH2Br,oder ein Stickstoffsubstituent, wie z. B. -NH2,-NHR, -NRR' (mitR, R' = Alkyl, Arylusw.), -NC oder -NO2, oder Fluor, Chlor,Brom, Iod, -CN oder ein Heterosubstituent sind, wobei im Falle vonR6 unterschiedlich von R7 oderR4 unterschiedlich von R5 oderbei sterisch anspruchsvollen (d.h. großen, raumfüllenden oder auch sperrigen)Arylresten, z.B. mit voluminösenortho-Substituenten,R1-R3 sowie R8-R11 die Verbindung zentro-oder axialchiral sein kann, sowie alle auftretenden Stereoisomereund racemischen Gemische davon, zwei oder mehr Reste (z. B. einRest R1 und ein Rest R2 oderein Rest R4 und ein Rest R6)könnenso untereinander in der Art verknüpft sein, dass dadurch einiso- oder heteroaromatischeroder gesättigterRing gebildet ist. So kann z. B. R1 plusR2 auch ein an zwei benachbarten Kohlenstoffeatomendes Pyrrolgerüstskondensierter aromatischer oder gesättigter Ring sein. Außerdem bestehtdie Maßgabe,dass Formel 23 nicht die folgende Formel 22 bedeutet:
    [0012] Umfaßt sindaußerdemGemische verschiedener dieser Verbindungen, die zum Beispiel zueinem auf die jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder den Patientenauf Basis von diagnostischen oder Daten über den Behandlungserfolg oder-verlauf abgestimmten "personalisierten" Medikament verarbeitetwerden können.Unter einem Derivat wird auch eine Verbindung entsprechend der allgemeinenFormel 23 verstanden, die aus anderen (z. B. marinen) Organismenisoliert werden kann, als dem hier (beispielhaft) erwähnten.
    [0013] Untereinem "Vorläufer" einer Substanz sollim Rahmen der vorliegenden Erfindung zum einen eine Substanz verstandenwerden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch dieBedingungen im Körper(z. B. pH im Magen, oder ähnliches)so verändertwird, oder aber durch den Körpernach Aufnahme so metabolisiert wird, dass sich als wirksame Substanzdie erfindungsgemäße Verbindungoder deren Derivate bilden.
    [0014] Damininist ein bisher unbekannter Naturstoff und die Pyrrolalkaloid-Derivatenach der allgemeinen Formel 23 sind davon abgeleitete Syntheseprodukte,die bisher unbekannt waren und deren Wirkung nicht beschrieben ist.
    [0015] Dieseerfindungsgemäßen Verbindungenkönnenmit den üblichenLösungsmitteln,Hilfs- und Trägerstoffenzu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions-und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutischzur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendungzu finden.
    [0016] Dievorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellungder Substanz Daminin (24), das dadurch gekennzeichnet ist, dassdie Substanz aus einem marinen Organismus, bevorzugt dem SchwammAxinella damicornis, gewonnen wird. Des Weiteren betrifft die Erfindungein Verfahren zur Herstellung des Naturstoffs Daminin (24) und vonPyrrolalkaloiden der allgemeinen Formel 23 durch chemische Synthesegemäß der Schemata1 oder 2, wie in den Beispielen angegeben.
    [0017] Einweiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendungmindestens einer der oben genannten Verbindungen zur Behandlungvon Erkrankungen, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungen des ZNS,Ischämie,Alzheimer-Krankheit, psychopathologischen Krankheiten. Diese Verwendungkann zum Beispiel in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammenmit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oderTrägersubstanzerfolgen. Im Falle der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungenwird eine Behandlung in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,5und 3,0 μg/mlbevorzugt.
    [0018] Einweiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutischeZusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, zusammen mitgeeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen. Diese pharmazeutische Zusammensetzungkann dadurch gekennzeichnet sein, daß die Verbindung in Form einerDepotsubstanz oder als Vorläuferzusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichenVerdünnungslösung oderTrägersubstanzvorliegt.
    [0019] Besondersbevorzugt werden pharmazeutische Zusammensetzung, in denen die erfindungsgemäße Verbindungin solch einer Menge vorliegt, daß ein Konzentrationsbereichzwischen 1,0 und 3,0 μg/mlbei der Behandlung in vivo vorliegt.
    [0020] Erfindungsgemäß kann dieoben genannte pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten,Dragees, Kapseln, Tropflösungen,Suppositorien, Injektions- oderInfusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralenVerwendung vorliegen. Solche Darreichungsformen und deren Herstellungsind dem Fachmann bekannt.
    [0021] DieErfindung soll nun im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezugauf die bei gefügtenFiguren weiter verdeutlicht werden, ohne jedoch auf diese Beispielebeschränktzu werden. Es zeigt
    [0022] 1:Reduktion des durch den Glutamatrezeptor-Agonisten L-Glutamat inNeuronen hervorgerufenen Anstiegs des intrazellulären Calcium-Spiegelsdurch das neue Pyrrolalkaloid Daminin (24). In der Kontrollseriewurden die Neuronen nur mit L-Glutamatbehandelt [offene Kreise]. In den Testserien wurden die Neuronenmit steigenden Konzentrationen an Daminin (24) (0,5 μg/ml [gefüllte Dreiecke];1,0 μg/ml[offene Quadrate]; beziehungsweise 3,0 μg/ml [offene Rauten]) für 5 Minutenvorinkubiert. Anschließendwurde in die AnsätzeL-Glutamat (10 Min.) hinzu gesetzt. Die Änderungskinetik wurde kontinuierlichgemessen. Der Mittelwert (n = 35) als auch die Standardabweichung(± SE)wurden ermittelt.
    [0023] 2:In dieser Versuchsreihe wurde NMDA als Agonist für den Glutamatrezeptor aufNeuronen eingesetzt. Auch dieser bewirkt eine starke Zunahme derKonzentration an intrazellulärenCalcium-Ionen ((gefüllteRauten]). Werden die Neuronen jedoch mit dem neuen PyrrolalkaloidDaminin (24) (1 μg/ml)vorinkubiert (5 Min.), kommt es zu einer signifikanten Reduktiondieser Zunahme ([offene Quadrate]). Der Mittelwert (n = 30) alsauch die Standardabweichung (± SE)wurden ermittelt.
    [0024] ImNovember 2001 wurden in der Bucht von Calvi (Korsika) Exemplaredes Schwammes Axinella damicornis gesammelt und bis zur weiterenBearbeitung tiefgefroren. Zur Extraktion wurde der frisch aufgetaute Schwammhomogenisiert und bei Raumtemperatur zuerst mit Methanol und anschließend mitChloroform behandelt. Die Extrakte wurden in vacuo aufkonzentriertund die wasserunlöslicheLipidfraktion mit n-Butanol behandelt. Der in n-Butanol lösliche Anteilwurde einer MPLC-Trennungauf einer "reversed-phase"-Säule unterzogen,wobei ein Eluentengradient von Wasser über Methanol nach Chloroformverwendet wurde. Zwei Alkaloidhaltige Fraktionen wurden mit Methanol/Wasser(3:7) (Fraktion A) bzw. Methanol/Wasser (2:8) (Fraktion B) eluiert.Die polarere Fraktion A wurde durch HPLC auf einer RP-18-Säule (Luna, 5 μm, 4,6 × 250 mm)aufgetrennt und übereine weitere HPLC auf einer C-18-Säule (AQUA, 5 μm, 4,6 × 250 mm)aufgereinigt, wodurch Verbindung 24 (4 mg) als Reinsubstanz erhaltenwurde. Fraktion B wurde durch zwei aufeinanderfolgende HPLC-Trennungenauf RP-18-Säulen,mit Methanol/Wasser (1:1) als Eluent, aufgereinigt (Luna, 5 μm, 4,6 × 250 mm;Luna 3 μm,4,6 × 250mm), dadurch wurden 3 mg der reinen Verbindung 22 erhalten.
    [0025] DerVergleich der Spektraldaten von 22 mit Literaturwerten, zeigte,dass es sich um die aus Agelas longissima bekannte Verbindung Agelongin(F. Cafieri, E. Fattorusso, A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati,R. Carnuccio, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 799-804) handelte.
    [0026] DieSummenformel C13H12N2O4 für Verbindung24 wurde aus dem HRFAB-Massenspektrum(gemessen: m/z 261,0890; berechnet: m/z 261,0875) abgeleitet. DasVorhandensein einer aromatischen Esterfunktion und einer Carboxylatgruppewurde aus den IR-Absorptionen bei νmax 1710cm–1 bzw.1646 cm–1 abgeleitet,erhärtetwurde dieser Befund durch die Signale im 13C-NMR-Spektrumbei δ161,6und δ159,0.Darüberhinaus zeigtedas 13C-NMR-Spektrum sieben sp2-Methinsignaleund zwei nicht protonierte sp2-Kohlenstoffe,ein Hinweis auf aromatische Ringsysteme, sowie zwei sp3-Methylensignale.Im 1H-NMR-Spektrum (in DMSO-d6)waren zehn gut aufgelösteSignale zu sehen: sieben aromatische Protonensignale, ein mit D2O austauschbares Proton sowie zwei miteinanderkoppelnde Methylensignale im mittleren ppm-Bereich (siehe Tabelle1). Die Auswertung der NMR-Spektren, inklusive COSY, ROESY, HSQCund HMBC, zeigte eindeutig, dass die Struktur von 24 große Ähnlichkeitenzu Agelongin (22) aufweist. Aus den Spektraldaten ergeben sich zweiheterozyklische Teilstrukturen, ein Pyridinium-β-Carboxylat und ein Pyrrol-2-Carbonsäureester,die durch eine Ethylenbrückeverbunden sind. Somit ist Verbindung 24 das nicht-bromierte Analogonvon Agelongin. Die NMR-Spektren erlaubten die vollständige undeindeutige Zuordnung aller 13C- und 1H-Resonanzen; insbesondere die chemischenVerschiebungen der Pyrrolgruppe zeigten eine gute Übereinstimmungmit bekannten 2-substituierten Pyrrolen (J. Kobayashi, F. Kanda,M. Ishibashi, H. Shigemori, J. Org. Chem. 1991, 56, 4574-4576; Y.Cheng, N. Tan, R. Teng, Y. Lu, C. Wang, Q. Zheng, J. Nat. Prod.2002, 65, 750-752).
    [0027] ZurSynthese von 23, könnenzwei verschiedene Vorgehensweisen gewählt werden, die in Schema 1 und2 dargestellt sind. Der erste Weg (siehe Schema 1) beginnt mit demPyrrolteil des Moleküls,der Pyrrol-2-Carbonsäure25 (R1-R3 = H),welche in das bekannte Säurechlorid26 überführt (T.J. Donohoe, P. M. Guyo, J. Org. Chem. 1996, 61, 7664-7665) wirdund anschließendmit einem Überschussan Ethylenglykol (27, R4-R7 =H) zum Monoester 28 (R1-R7 =H) umsetzt. Alternativ kann 28 (R1-R7 = H) aus 25 (R1-R3 = H) auch direkt erhalten werden, indemein Überschussan Ethylenglykol (27, R4-R7 =H) und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid), oder ein anderes wasserentziehendesMittel, eingesetzt wird.
    [0028] Dieweitere Umsetzung von 28 zum Bromid 29 (R1-R7 = H) wird zum Beispiel durch den Einsatzvon 1,2-Dibromtetrachlorethan in Kombination mit Triphenylphosphanerreicht (G. Bringmann, S. Schneider, Synthesis 1983, 139-141).Dieses Bromid 29 (R1-R7 =H) kann nun, in Analogie zu anderen N-Alkylierungsreaktionen einfacherPyridine (z. B. R. C. Elderfield, B. Fischer, J. M. Lagowski, J.Org. Chem. 1957, 22, 1376-1380), mit Nikotinsäure (30, R8-R11 = H, X = OH) zum Zielmolekül 23 reagieren.
    [0029] MitHilfe dieses Syntheseweges ist, durch Variation von X sowie derReste am Pyrrolteil (R1-R3),an der "Ethylenbrücke" (R4-R7) und am Nikotinsäureteil (R8-R11), auch eine Vielzahl strukturell ähnlicherVerbindungen zugänglich.
    [0030] Derzweite Syntheseweg (siehe Schema 2) kann, unter bestimmten Umständen, sogarals Eintopfsynthese durchgeführtwerden. Dazu wird Verbindung 30 (R8-R11 = H, X = OH) durch N-Alkylierung mit dem Bromethanol31 (R4-R7 = H) indas Pyridiniumsalz 33 (R4-R11 =H, X = OH) überführt. Alternativkann zur N-Alkylierung auch das entsprechende Epoxid 32 (R4-R7 = N) verwendetwerden. Die Nukleophilie des Pyridins 30 kann durch den Einsatzals Carboxylatsalz (z. B. X = ONa oder OK) noch gesteigert werden.Die Veresterung des so erhaltenen Pyridiniumsalzes 33 mit dem Pyrrol-2-Carbonsäurechlorid26 (R1-R3 = H) ergibtdas Zielmolekül24 (R1-R11 = H,X = OH).
    [0031] Auchdieser Syntheseweg kann durch Variation der Reste R1-R11 (siehe Patentansprüche) und von X (welches, z.B., auch O-Alkyl, O-Aryl, NH2, NH-Alkyl,NH-Aryl, N-Alkyl2, N-Aryl2, N-Aryl-Alkyl,etc. sein kann) modifiziert werden.
    [0032] In ähnlicherWeise könnendie heterozyklischen Systeme, der Pyridin- und der Pyrrolring, durchandere Regioisomere (z. B. 3- an Stelle von 2-Pyrrolcarbonsäuren) oderauch durch andere mono-, bi- oder oligozyklische, hetero- oder isozyklische,gesättigteoder ungesättigteRingsysteme ersetzt werden.
    [0033] Darstellungdes 1-(2-Hydroxyethyl)-3-Methoxycarbonylpyridinium-Bromids (33a):Eine Lösungvon Nikotinsäuremethylester(30a; 1 g) und 2-Bromethanol (31a; 5 ml) in Toluol (7 ml) wurdeunter Rührenfür 2,5 Stundenauf 120°Cerhitzt. Das Lösungsmittelwurde im Vakuum entfernt und der Rückstand dreimal mit je 15 mlDiethylether gewaschen. Umkristallisation aus 60 ml Acetonitril-Diethylether(1:2) ergab das 1-(2-Hydroxyethyl)-3-methoxycarbonyl-Pyridiniumbromid(33a) in Form weißerKristalle (siehe Schema 3).
    [0034] Darstellungvon Daminin (24): Eine Suspension von Kaliumpyrrol-2-carboxylat(25a; 230 mg) in Oxalylchlorid (0,25 ml) und Dichlormethan (5 ml)wurde bei Raumtemperatur (RT) unter Stickstoff gerührt. Nach4 Stunden wurde das Lösungsmittelim Vakuum entfernt, und der Rückstandwieder in 5 ml Dichlormethan gelöst.Zu dieser Lösungwurden 1-(2-Hydroxyethyl)-3-methoxycarbonyl-Pyridiniumbromid (33a,262 mg, Schema 3), Pyridin (0,24 ml) und eine katalytische MengeDimethylaminopyridin gegeben. Die Mischung wurde bei RT über Nachtgerührt.Anschließendwurde das Lösungsmittelim Vakuum entfernt und der Rückstandmit Diethylether gewaschen. Anschließend wurde der Rückstandin Pyridin (4 ml) gelöstund nach Zugabe von Lithiumjodid (900 mg) bei 100°C gerührt. Nach3 Stunden wurde das Lösungsmittelim Vakuum entfernt und der Rückstanddurch Säulenchromatographieaufgereinigt (SiO2, Ethylacetat/Methanol(2:8)). Der so erhaltene Feststoff wurde aus 12 ml Ethanol/Diethylether(2:1) umkristallisiert.
    [0035] Materialien:Es wurden die gleichen Materialien wie früher beschrieben verwendet (S.Perovic, A. Wichels, C. Schütt,G. Gerdts, S. Pahler, R. Steffen, W.E.G. Müller, Environm. Toxicol. Pharmacol.1998, 6, 125-133). Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2-AM) wurde von MolecularProbes (Leiden, Niederlande), "Dulbecco's modified Eagle's Medium" mit 4,5 g/L Glucose(DMEM/HG) von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) und die Antikörper "Mäuse-anti-Neurofilament" (68 kDa) und "Mäuse-Anti-Glial-Fibrillary-Acidic-Protein" (Anti-GFAP) vonRoche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) bezogen.
    [0036] Zellen:Die kortikale Zellkultur wurde aus den Gehirnen von 17-18 Tage altenRattenembryonen nach R. I. Freshney (In: Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique (Hrsg.: R. I. Freshney), A. R. LissInc., New York, 1987, S. 257-288) erhalten; die Methode wurde leichtmodifiziert (S. Perovic, C. Schleger, G. Pergande, S. Iskric, H.Ushijima, P. Rytik, W. E. G. Müller,Eur. J. Pharmacol. (Mol. Pharmacol. Sec.) 1994, 288, 27-33). Zusammenfassendwurden die Neuronen aus den Cerebral-Hemisphären isoliert und diese in "Hank's balanced salt solution" ohne Ca2+ undMg2+ (HBSS) überführt. Die Zellen wurden in HBSSmit Hilfe von 0,025% (w/v) Trypsin (10 Min.; 37°C) dissoziiert. Die proteolytischeReaktion wurde mit 10% (v/v) fötalemKälberserum (FKS)beendet. Die Einzelzell-Suspension wurde zentrifugiert und das resultierendePellet mit DMEM/HG/10% FKS-Medium aufgenommen. Die Zellen wurdenin eine mit Poly-L-Lysin (5 μg/ml,300 μl/cm2) beschichtete Kammer mit einer Zelldichtevon 2,0 × 105 Zellen/cm2 ausplattiert.Das DMEM/HG/10% FKS-Mediumwurde zwei Tage nach der Isolierung entfernt und durch DMEM/HG/serumfreiesMedium ersetzt. Sieben Tage nach der Isolierung erfolgte eine Immunfärbung mit "Anti-Neurofilament"-Antikörper (gegenein 68-kDa-Protein) als Marker fürNeuronen und "Anti-GFAP" als Marker für Gliazellen.Die Kulturen enthielten > 80%Neuronen; die restlichen Zellen waren GFAP-positiv und stelltenhauptsächlichAstrozyten dar.
    [0037] Beladenvon Neuronen mit Fura-2-AM: Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration([Ca2+]i) wurdedurch Fluoreszenzmessungen bestimmt. Als Parameter wurde das Verhältnis derFluoreszenz des Ca2+-IndikatorfarbstoffesFura-2-AM bei den Wellenlängenvon 340 und 380 nm herangezogen (G. Grynkiewicz, M. Poenie, R.Y. Tsien,J. Biol. Chem. 1985, 260, 3440-3450). Die Neuronen wurden mit 6 μM Fura-2-AMin DMEM/HG/serumfreiem Medium (plus 1 % Rinderserumalbumin) 60 Minutenlang bei 37°Cbeladen. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit Mediumgewaschen und weitere 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Diese Inkubationszeitist ausreichend, um die Neuronen zu beladen (inaktives Fura-2-AM)und den Acetoxymethylester (aktives Fura-2) zu hydrolysieren.
    [0038] EineCalcium-Kalibrierungskurve wurde nach der Methode von Grynkiewiczet al. (G. Grynkiewicz, M. Poenie, R.Y. Tsien, J. Biol. Chem. 1985,260, 3440-3450) erstellt. Fluoreszenzbilder wurden bei 340 und 380 nmerhalten. Der Quotient aus den bei den Fluoreszenzdaten (340/380nm) wurde berechnet und fürdie Erstellung der Kalibrierungskurve eingesetzt. Ein Quotient (Ratio)von 1,0 entsprach 228 nM [Ca2+]i.
    [0039] Versuchsansatz – Änderungendes Calciumspiegels in Neuronen: In dieser Versuchsreihe wurdendie Zellen zuerst mit Fura-2-AM beladen und anschließend mitden Testsubstanzen (in Locke'sLösung;154 mM NaCl; 5,6 mM KCl; 3,6 mM NaH-CO3; 5,6 mMGlucose und 10 mM HEPES; pH 7,4; ohne CaCl2)behandelt. Daminin (24) wurde in Wasser (Konzentration: 10 mg/ml)gelöstund bei 4°Cgelagert. Neuronen wurden im ersten Ansatz (Kontrollen) nach 10Minuten mit 200 μlL-Glutaminsäure (L-Glu)oder 200 μMN-Methyl-D-Asparaginsäure(NMDA) und 2,4 mM CaCl2 stimuliert. Im Testansatzwurden die Zellen mit dem Daminin (24) zunächst vorinkubiert (5 Minutenmit 0,5; 1,0; 3,0 μg/mlDaminin); anschließendwurden 200 μML-Glu oder 200 μMNMDA und 2,4 mM CaCl2 zu den Ansätzen zugegeben(für 10Minuten), und es wurde die Änderungdes Calciumspiegels der vorinkubierten Neuronen bestimmt. Die Versuchsdauerzur Messung des [Ca2+]i-Spiegels betrug20-27 Minuten.
    [0040] ZurDurchführungwurden die Zellen auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläsern im4-Kammer-System (Lab-Tek® Chamber SlideTM-System; Nunc, Wiesbaden, Deutschland)kultiviert. Mit einem "inverted-stage"-Mikroskop OlympusIX70 mit apochromatisch reflektierendem Licht und dem Fluoreszenzobjektiv UApo40X/340wurden die Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Die Zellen wurden alternierendmit Licht der Wellenlängen340 und 380 nm mit Hilfe eines computergesteuerten Schmalband-Interferenzfiltersvor einer 100-W-Xenon-Lampe beleuchtet. Zusätzlich wurde ein 0,25-ND-Filterfür 380nm benutzt. Die Fluoreszenzemissionen bei 510 nm wurden mit einerCCD-Kamera (Modell C2400-87; Hamamatsu, Herrsching, Deutschland)aufgezeichnet. Die Bilder wurden computergestützt, mit dem Imaging-SystemArgus 50, Hamamatsu, digitalisiert als 256 × 256 pixels mit 8-bit-Arrays.Der Quotient (Ratio) 340/380 nm wurde durch Division der Bilderpaareermittelt.
    [0041] Statistik:Die Ergebnisse wurden mittels eines gepaarten Student's t-test (L. Sachs,Angewandte Statistik (Springer, Berlin) (1984) Seite 1-552 ausgewertet.
    [0042] Ergebnisse:Die Neuronen wurden mit dem neuen Pyrrolalkaloid Daminin (24) vorinkubiert(5 Minuten) und anschließendmit L-Glutamat (200 μM)oder N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA;200 μM)in Anwesenheit von 2,4 mM CaCl2 behandelt.Wurde L-Glutamat als Agonist eingesetzt und die Neuronen ohne Pyrrolalkaloid inkubiert,wurde ein Anstieg von intrazellulärem Calcium ([Ca2+]i) von einem Ratio-Quotient von 0,75 ± 0,07 auf ein Ratio-Quotientvon 2,29 ± 0,13(305%) ermittelt (1). Wurde hingegen NMDA eingesetzt,wurde ein Anstieg des Ratio-Quotientes von 0,83 ± 0,04 auf 1,95 ± 0,08(235%) gemessen (2). Die Kontrollen wurden dabeials 100% angenommen.
    [0043] EinePräinkubationder Neuronen mit 0,5, 1,0 und 3,0 μg/ml Daminin (24) zeigte einenAbfall des [Ca2+]i-Spiegelsnach der Zugabe von 200 μML-Glu und 2,4 mM CaCl2 (1).Der Abfall des [Ca2+]i-Spiegels warsignifikant und betrug etwa 65,7% bei 0,5 μg/ml (p < 0,05); 58,0% bei 1,0 μg/ml (p < 0,001) und 25,1%bei 3,0 μg/ml(p < 0,001; 1).
    [0044] DieAbnahme der freien Calciumkonzentration in Neuronen nach Präinkubationmit 1,0 μg/mlDaminin (24) und anschließenderInkubation mit 200 μMNMDA war ebenfalls signifikant; im Vergleich zur Kontrolle warendie Werte um 36,5% (p < 0,05; 2;)gesunken.
    [0045] Ausden in der 1 (Agonist: L-Glutamat) zusammengefasstenDaten geht hervor, dass das neuen Pyrrolalkaloid Daminin (24) bereitsin den niedrigen Konzentrationen von 0,5 μg/ml signifikant den Anstiegan intrazellulärenCalcium-Ionen reduziert. Bei höherenKonzentrationen ist dieser protektive Effekt noch stärker.
    [0046] Auchaus dieser Serie muß derSchluß gezogenwerden, daß dasneue Pyrrolalkaloid Daminin (24) auch in dem Versuchssystem mitdem NMDA-Agonisten eine sehr ausgeprägte Protektionswirkung gegenüber NMDAbesitzt (2; Agonist: NMDA).
    [0047] Insgesamtzeigen diese Ergebnisse, daß dieVorinkubation von Neuronen mit niedrigen Konzentrationen des neuenPyrrolalkaloids Daminin (24) eine signifikante Neuroprotektion bewirkt.
    权利要求:
    Claims (12)
    [1] Verbindung der allgemeinen Formel 23:
    [2] Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel 24:
    [3] Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch1 oder 2, umfassend die Isolierung der Verbindung aus einem Schwammder Gattung Axinella, insbesondere Axinella damicornis.
    [4] Verfahren zur Synthese einer Verbindung der allgemeinenFormel 23 nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß dem folgendenallgemeinen Schema a) eine Pyrrolcarbonsäure der allgemeinen Formel25 mit einem Diol der allgemeinen Formel 27 zu einer Verbindungder allgemeinen Formel 28 verestert, b) eine Verbindung derallgemeinen Formel 28 durch Hydroxy/Halogenaustausch zu einem Halogenidder allgemeinen Formel 29 umsetzt, und c) eine Halogenverbindungder allgemeinen Formel 29 mit einem Pyridinderivat der allgemeinenFormel 30 unter nucleophiler Substitution zu einem Pyridiniumsalzder allgemeinen Formel 23 umsetzt,
    [5] Verfahren zur Synthese einer Verbindung der allgemeinenFormel 23 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß dem folgendenallgemeinen Schema a) eine Pyridin-Verbindung der allgemeinenFormel 30 mit einem Halogenid der allgemeinen Formel 31 oder miteiner Epoxid-Verbindung der allgemeinen Formel 32 unter Epoxid-Öffnung zueiner Pyridinium-Verbindung der allgemeinen Formel 33 umsetzt, und b)eine Verbindung der allgemeinen Formel 33 mit einer Pyrrolcarbonsäure derallgemeinen Formel 25 zu einer Verbindung der allgemeinen Formel23 unter Veresterung umsetzt,
    [6] Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, weiterhin umfassendeine anschließendesynthetische Derivatisierung der dargestellten Verbindungen.
    [7] Verbindung der allgemeinen Formel 23 nach Anspruch1 als Medikament zur Präventionoder Behandlung von Erkrankungen.
    [8] Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutischwirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, gegebenenfallszusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen.
    [9] Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8,dadurch gekennzeichnet, daß dieVerbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammenmit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oderTrägersubstanzvorliegt.
    [10] Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Oberflächenbeschichtungvon medizinischen Vorrichtung, als Zusatz von Werkstoffen oder Spüllösung vorliegt.
    [11] Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis10 in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen,Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen,rektalen oder parenteralen Verwendung.
    [12] Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder2 zur Behandlung und Präventionvon neurodegenerativer Erkrankungen.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE102004002885B4|2007-03-15|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-08-18| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2007-09-13| 8364| No opposition during term of opposition|
    2009-11-19| 8339| Ceased/non-payment of the annual fee|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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